Для проведения НИР и НИОКР предприятие по разработке покрытий из модифицированного хитозана и разработке способа нанесения хитозана на эндопротезы компания ООО «ТИТАНМЕД» заключила долгосрочный договор с Федеральным государственным автономным образовательным учреждением высшего образования "Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского" (ННГУ), для выполнения работ был привлечен научный коллектив, возглавляемый д.х.н., профессором Смирновой Л.А. и д.х.н. Зайцевым С.Д.

Научные интересы коллектива в области медицины: эндопротезирование при заболеваниях, травмах и последствиях травм тазобедренного, плечевого, голеностопного суставов; накостный и интрамедуллярный остеосинтез трубчатых костей крупных сегментов; хирургическое лечение внутрисуставных переломов; Эндопротезирование с использованием компьютерной навигации, индивидуальных резекционных блоков и 3D моделирования; проведение испытаний по определению цитотоксичности, генотоксичности, канцерогенности, острой и хронической токсичноти, имплантационные тесты. В области химии научные интересы коллектива охватывают радикальную полимеризацию и сополимеризацию, физико-химию растворов полимеров, физико-механику полимерных материалов, полимерные нанокомпозиты, биоразлагаемые и природные полимеры. За последние годы коллективом достигнуты значимые результаты в области создания биоразлагаемых полимеров, синтезируемых на основе природных и синтетических полимеров, предназначенных для применения в фармацевтике и общей химической промышленности. Благодаря этим работам коллектив приобрел мировую известность. Разработан и успешно внедрен новый кровоостанавливающий материал, по которому получен Евразийский патент и ведется экспертиза по РСТ.

Научный коллектив предлагаемого проекта проводит инициативные исследования композиций на основе хитозана, обладающих бактерицидными свойствами, для использования их в качестве защиты титановых имплантатов от биообрастания. Ведутся лабораторные работы по модификации хитозана антибиотиками, ионами и наночастицами серебра. Исследован процесс формирования защитной оболочки модифицированного хитозана на поверхности титановых пластин и ее свойства в зависимости от конформации макромолекул и молекулярной массы хитозана, природы и концентрации кислоты. Выявлено влияние конформационного состояния макромолекул хитозана на однородность образующегося защитного слоя. Методом решетчатого надреза изучена адгезионная прочность защитной оболочки к поверхности титановых пластин и ее существенная зависимость от конформации цепей полисахарида. Исследованы антибактериальные свойства покрытий по отношению к Staphylococcus Aureus.

Завершены НИОКР:

  1. Получены растворы с ХТЗ, содержащие гентомицин
  2. Формирование покрытия на поверхности титана из состава

Лабораторные образцы покрытия формировали из растворов ХТЗ в водных растворах УК формованием на поверхности титановых пластин с равномерным испарением растворителя. Установлено, что при использовании 3% ХТЗ в водном растворе 1,5% УК формование приводит к образованию хитозановой пленки на поверхности титановой пластины, которая после высушивания образца была неоднородной и с дефектами.

Методом решетчатого надреза определена адгезионная прочность покрытий. Помещали испытуемые титановые пластины на твердую поверхность, чтобы не допустить их деформации во время испытаний. Выполняли надрезы вручную. Наносили на покрытие несколько надрезов, после повторили указанную операцию под углом 90° к первоначальным надрезам для получения решетки с четко выраженными точками пересечения. Удалили кисточкой отслоившиеся покрытия с площади надрезов. Идентифицировали адгезионную прочность в соответствии с ГОСТ 31149-2014. Наилучшие показатели адгезионной прочности были выявлены в случае покрытий на титановых пластинах с ММ ХТЗ 2,0∙105. Для этих образцов адгезионная прочность составила 0 баллов: края надрезов полностью гладкие, ни один из квадратов в решетке не отслоился.

Лабораторные образцы титановых пластин с ионами и наночастицами серебра, а также с антибиотиком были исследованы на бактерицидные свойства на примере бактерий Staphylococcus Aureus. Установлена высокая антибактериальная активность покрытия – радиус зоны ингибирования составлял 15 мм.

Наночастицы серебра формировали двумя подходами. Первый заключался в том, что наночастицы получали восстановлением ионов серебра из раствора, содержащего в качестве прекурсора азотнокислое серебро. После высыхания пленки подвергали механическому воздействию, в результате чего они отделялись. Второй подход основан на том, что титановые пластины с однородным покрытием на основе 3% ХТЗ в водном растворе 6% УК с добавлением ионов серебра, которые по качеству и однородности значительно превышали пленки, полученные формованием из 3% ХТЗ в водном растворе 6% УК с добавлением наночастиц серебра, были подвержены УФ-излучению для формирования наночастиц серебра. Подтверждением формирования наночастиц является полоса, обусловленная плазмонным поглощением наночастиц, в интервале 363-469 нанометров с максимумом поглощения 428 нанометров.

Результаты исследований:

  1. PROPERTIES OF SOLUTIONS AND FILMS OF CHITOSAN BLENDS WITH POLY(VINYL ALCOHOL) Mukhina V.R., Pastukhova N.V., Semchikov Yu.D., Smirnova L.A., Kir'yanov K.V., Zhernenkov M.N. Высокомолекулярные соединения. Серия А. 2001. Т. 43. № 10. С. 1797-1804.
  2. ВЯЗКОСТНЫЕ СВОЙСТВА РАСТВОРОВ ХИТОЗАНА И ЕГО РЕАКЦИОННАЯ СПОСОБНОСТЬ Федосеева Е.Н., Смирнова Л.А., Федосеев В.Б. Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2008. № 4. С. 59-64.
  3. МЕХАНИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПЛЕНОК ХИТОЗАНА РАЗЛИЧНОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ Федосеева Е.Н., Алексеева М.Ф., Смирнова Л.А. Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2008. № 5. С. 58-62.
  4. ОСОБЕННОСТИ МЕХАНИЧЕСКИХ ИСПЫТАНИЙ ПЛЕНОК ХИТОЗАНА Федосеева Е.Н., Алексеева М.Ф., Нистратов В.П., Смирнова Л.А. Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2009. Т. 75. № 7. С. 42-46.
  5. ХИТОЗАН, МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ДИАЗИДОМ ТЕРЕФТАЛЕВОЙ КИСЛОТЫ, КАК СРЕДСТВО ДОСТАВКИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ Одиноков А.В., Джонс Д.Ю., Будруев А.В., Мочалова А.Е., Смирнова Л.А. Известия Академии наук. Серия химическая. 2016. № 4. С. 1122-1130.
  6. ВЛИЯНИЕ НАНОСТРУКТУРИРОВАННЫХ СИСТЕМ "ХИТОЗАН-НАНОЧАСТИЦЫ ЗОЛОТА", "ХИТОЗАН-ПЧЕЛИНЫЙ ЯД-НАНОЧАСТИЦЫ ЗОЛОТА" НА СТРУКТУРУ И МАССУ ОПУХОЛИ, ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ КРЫС С ОПУХОЛЬЮ РС-1 Дыдыкина В.Н., Ерёмина Ю.Д., Корягин А.С., Смирнов В.П., Смирнова Л.А. Медицинский альманах. 2016. № 2 (42). С. 133-137.
  7. ХИТОЗАН, МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ДИАЗИДОМ ТЕРЕФТАЛЕВОЙ КИСЛОТЫ, КАК СРЕДСТВО ДОСТАВКИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ Одиноков А.В., Джонс Д.Ю., Будруев А.В., Мочалова А.Е., Смирнова Л.А. Известия Академии наук. Серия химическая. 2016. № 4. С. 1122-1130.
  8. ВЛИЯНИЕ НАНОСТРУКТУРИРОВАННЫХ СИСТЕМ "ХИТОЗАН-НАНОЧАСТИЦЫ ЗОЛОТА", "ХИТОЗАН-ПЧЕЛИНЫЙ ЯД-НАНОЧАСТИЦЫ ЗОЛОТА" НА СТРУКТУРУ И МАССУ ОПУХОЛИ, ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ КРЫС С ОПУХОЛЬЮ РС-1 Дыдыкина В.Н., Ерёмина Ю.Д., Корягин А.С., Смирнов В.П., Смирнова Л.А. Медицинский альманах. 2016. № 2 (42). С. 133-137.
  9. ПОЛУЧЕНИЕ БИОДЕГРАДИРУЕМЫХ МАТЕРИАЛОВ НА ОСНОВЕ БЛОК-И ПРИВИТЫХ СОПОЛИМЕРОВ ХИТОЗАНА И МЕТИЛАКРИЛАТА Смирнов В.Ф., Мочалова А.Е., Белышева И.В., Маркин А.В., Батенькин М.А., Смирнова Л.А. Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2009. № 5. С. 95-102.

Кроме лабораторных образцов с ионами и наночастицами были подготовлены образцы титановых пластин, покрытых новым полимерным покрытием с антибиотиком (гентамицином), сравнение результатов приведены в таблице ниже:

Для исследования использовали штаммы бактерий Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и Escherichia coli. Агаризованную среду мясопептонного агара в чашках Петри инокулировали суспензией бактерий, помещали на газон бактерий титановые пластины с покрытием и в качестве контроля без покрытия, термостатировали сутки при температуре 37 ⁰С.

После этого измеряли зону ингибирования (диаметр):

  • d = до 4 мм – небактерицидные
  • d = 4-9 мм – малобактерицидные
  • d = 9-19 мм – бактерицидные
  • d > 19 мм - сильнобактерицидные

1.Раствор ХТЗ с серебром

Stalihiloccocus aureus
liseudomonas aeruginosa
Escherichia coli

2.Раствор ХТЗ с антибиотиком

Staphiloccocus aureus
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa (винт)

Таблица. Результаты антибактериального исследования наполимерных пленок на титановых пластинах

Бактерии
Условия нанесения покрытия Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli
1 Раствор ХТЗ с серебром 16 мм (бакт.) 20 мм (сильнобакт.) 16 мм (бакт.)
2 Раствор ХТЗ с антибиотиком 15 мм (бакт.) 20 мм (сильнобакт.) 16 мм (бакт.)
+ винт - 20 мм (сильнобакт.) -

Кроме проведения тестов на антибактериальность, проведена серия испытания на биодеструкцию покрытий. Изучение биодеструкции проводили на экспериментальных животных по изменению массы и размеров пленок (без титановых имплантов) хитозана и пленок хитозана, содержащих гентамицин, имплантированых экспериментальным животным в межлопаточную область спины. Работа проведена на белых нелинейных крысах-самках трехмесячного возраста массой 150-200 г. Все работы проводились на наркотизированных животных. Все процедуры на лабораторных животных осуществлялись в соответствии с требованиями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18 марта 1986); Международными рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (1993); Правила лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ №267 от 19.06.2003) и Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (МЗ №755 от 12.03.1977).

Таблица. Характеристики пленок в процессе их биодеградации в организме крыс

Видно, что хитозановая пленка биодеградирует в организме в течение 4 недель. Введение антибиотика в пленку замедляет процесс биодеградации, обеспечивая пролонгированность выделения антибиотика до 8 недель.

Следующим этапом исследования биодеструкции покрытий было введение титановых имплантов с покрытие в биологическую модель. Образцы винтов с покрытием вводились на ½ в кости крупных лабораторных животных (свиней), с последующим извлечением через 7 суток. Результаты гистологического исследования образцов приведены ниже:

Макроспически: Во всех 3 костных блоках гнойно-некротического расплавления и полостей не выявлено. Имплантат погружен в костную ткань на 50% от длины самого имплантата. Окружен мягкоткаными структурами.

Микроскопически: при исследовании гистологических стекол, окрашенных гематоксилином и эозином, отмечается посттравматический воспалительный процесс, лейкоцитарная инфильтрация. Фрагменты от покрытия не выявлены, но имеются полости, в которых предположительно могли находиться эти фрагменты. Соединительная ткань в области эксперимента представлена большим количеством ретикулярной ткани, с высоким содержанием ретикулярных клеток и фибробластов. На оставшейся части исследуемого фрагмента имеется плотная оформленная соединительная ткань, также выявляются отдельные участки деструкции поврежденной ткани. Между сосудами много недифференцированных лимфоцитоподобных клеток соединительной ткани. Процессы неоангиогенеза не выраженные. Под соединительной тканью выявлена свежая гематома, которая расслаивала соединительную ткань. Оценка стёкол, окрашенных по методу Ван-Гизона выявила, встречались преимущественно аргирофильные волокна.

Таким образом, можно судить о биодеструкции полимерного материала, и как следствии высвобождении антибиотика как в моделях на малых лабораторных животных, так и на более реалистичной модели имплантации образца крупному лабораторному животному.

В результате НИОКР и проведения доклинических испытаний был получен резорбируемый биополимерный матрикс, являющийся носителем лекарственных средств

Предприятием-разработчиком впервые как в России, так и в мире был получен резорбируемый биополимерный матрикс, являющийся носителем лекарственных средств (таких как антибиотики и т.д.). Область применения нового материала – травматология и ортопедия, а именно покрытия металлических имплантатов для остеосинтеза. Разрабатываемый материал позволяет дозированно в течение нескольких недель высвобождать лекарственное средство непосредственно в раневую область, тем самым минимизируя риски инфекционных послеоперационных осложнений. Также, биополимерный комплекс улучшает адгезию имплантата к раневой поверхности, положительно влияет на сам процесс регенерации.